CRISPR-Cas9, la coupure de l’ADN
L’animation 3D de la vidéo, rejouable et manipulable : Cas9 cherche le PAM, ouvre l’ADN, et coupe. Mets en pause, masque des pièces, déplace-les, puis remets tout en place.
Les variables
- La lecture : l’animation de la vidéo, à vitesse normale, ralentie ou accélérée, étape par étape
- Les pièces : chaque domaine de Cas9, l’ARN guide et les deux brins d’ADN, à afficher ou masquer
- La position des pièces : les déplacer, les écarter, puis les remettre en place
- La caméra : celle de la vidéo, ou libre (rotation, zoom)
Les chiffres clés
- 20 nt
- longueur de l’espaceur de l’ARN guide
- NGG
- PAM reconnu par SpCas9
- 3 pb
- distance entre le PAM et la coupure
- 1 368
- acides aminés dans SpCas9 (≈ 160 kDa)
- 4
- structures réelles de la Protein Data Bank
Ce qui se passe, étape par étape
- 01
Un ARN qui sert de guide
Cas9 est une protéine de la bactérie Streptococcus pyogenes. Seule, elle ne sait pas où couper. Elle porte un ARN guide (chez la bactérie, il est formé de deux ARN ; les chercheurs les ont fusionnés en un seul) dont les 20 premières lettres, l’espaceur, sont choisies par le chercheur : elles reproduisent la séquence d’ADN à viser.
- 02
Le PAM, un laissez-passer
Cas9 ne lit pas tout le génome lettre à lettre. Elle cherche d’abord un court motif, le PAM (NGG pour Cas9 de S. pyogenes), grâce à son domaine PI. Sans PAM juste à côté, même une séquence parfaitement complémentaire est ignorée. C’est aussi ce qui protège la bactérie : dans son propre réseau CRISPR, les espaceurs ne sont pas suivis d’un PAM.
- 03
La boucle R
Une fois le PAM reconnu, Cas9 écarte les deux brins juste à côté. L’ARN guide s’apparie au brin cible, lettre à lettre, en partant du PAM. Le brin non-cible est repoussé : c’est la boucle R. Les 10 à 12 premières paires, la région graine, doivent être parfaites ; une erreur à cet endroit arrête l’ouverture.
- 04
Deux lames, une cassure
Quand l’appariement est complet, le domaine HNH bascule et coupe le brin cible ; le domaine RuvC coupe le brin non-cible. Les deux coupures tombent 3 paires de bases avant le PAM : l’ADN est coupé net, en travers.
- 05
La cellule répare, et c’est là qu’on édite
Cas9 ne modifie rien elle-même : elle casse. La cellule recolle les extrémités. La jonction directe (NHEJ) est souvent exacte, mais Cas9 recoupe tant que la cible est intacte : à force, quelques lettres en plus ou en moins apparaissent, ce qui peut inactiver le gène. Si l’on fournit une matrice d’ADN, la réparation par recombinaison (HDR) peut recopier une séquence choisie.
Ce que la scène simplifie
- C’est l’animation de la vidéo : les vitesses sont modifiées et les mouvements schématisés.
- Les domaines de Cas9 sont des corps rigides, déplacés entre les poses de quatre structures réelles (4ZT0, 4UN3, 5F9R, 6O0Y) : un morphing, pas une simulation.
- L’ADN est représenté en perles (phosphate, sucre, base), ajusté sur le cristal 5F9R et prolongé par une hélice idéale ; la partie du brin non-cible non résolue dans le cristal est un arc schématique.
- La recherche du PAM est résumée à deux arrêts ; en réalité Cas9 diffuse en 3D et sonde de très nombreux PAM.
- Chaque atome est une sphère de van der Waals ; les hydrogènes ne sont pas représentés. Les couleurs sont des conventions de lisibilité.
- Les protéines du décor sont de vraies structures, placées pour évoquer l’encombrement de la cellule.
Pour aller plus loin
- Jinek et al., Science 337, 816 (2012)
Cas9 programmable par un ARN guide ; coupure 3 pb en amont du PAM.
- Nishimasu et al., Cell 156, 935 (2014)
Structure cristalline de SpCas9 ; lobes REC et NUC, domaines HNH, RuvC, PI.
- Sternberg et al., Nature 507, 62 (2014)
Recherche de la cible par interrogation des PAM ; région graine.
- Jiang et al., Science 348, 1477 (2015)
Cas9 chargée de son ARN guide (PDB 4ZT0).
- Zhu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 679 (2019)
Bascule du domaine HNH vers le brin cible, en présence de magnésium (PDB 6O0Y).
- Anders et al., Nature 513, 569 (2014)
Reconnaissance du PAM par le domaine PI (PDB 4UN3).
- Jiang et al., Science 351, 867 (2016)
Structure de la boucle R et mouvement du domaine HNH (PDB 5F9R).
Une IA peut-elle réinventer les ciseaux génétiques ?